在国家药品监督管理局发布的《细胞治疗产品研究与评价技术指导原则. (试行)》第五章:非临床研究中提到:对于采用基因修饰/改造的细胞治疗产品,需关注有复制能力的病毒的产生和插入突变,特别是致癌基因的活化等特性带来的安全性风险(2)。 为了检测细胞内相关致癌基因的变化,需要选定几种与癌症相关基因进行检测。通常细胞中存在原癌基因与抑癌基因两类。 原癌基因与抑癌基因介绍原癌基因是指存在于生物正常细胞基因组中的基因。正常情况下处于低表达或不表达状态,并发挥重要的生理功能。但在某些条件下,如病毒感染、化学致癌物或辐射作用等,原癌基因可被异常激活,转变为癌基因,能促进细胞增殖,阻止细胞凋亡使肿瘤逃逸周期抑制,从而使细胞失控生长诱导细胞发生癌变(3~4)。其中C‑MYC、 K‑RAS和C‑FOS这3种基因相对比较重要。 C‑MYC:既是一种可易位基因,又是一种多种物质调节的可调节基因,也是一种可使细胞无限增殖,获永生化功能,促进细胞分裂的基因,与多种肿瘤发生发展有关(5)。 K‑RAS:具有分子开关作用,在很多信号通路中具有重要作用(6)。研究表明约30%的人类恶性肿瘤与RAS基因突变有关,RAS突变后的产物可以一直处于活化状态。目前,K‑RAS基因突变状态检测在美国、欧洲及亚洲已经成为个体化靶向药物治疗的常规检测项目(7)。不合适的表达或突变,会直接干扰细胞周期的运行,或诱发细胞恶变、或在细胞周期的不同时期诱发细胞凋亡。 C‑FOS:参与细胞的正常分化、生长以及学习、记忆等过程,在脑内与皮层、海马、边缘系统、背海马、纹状体内FOS蛋白的表达密切相关(8)。 (原癌基因参与干细胞分化(9)) 抑癌基因是一类可抑制细胞增殖从而潜在抑制癌变作用的基因。正常情况下,抑癌基因通过抑制细胞周期,促进细胞衰老,或促进细胞凋亡来监控细胞状态,防止细胞异常增殖(3~4)。其中RB、P21和P53这3种基因相对比较重要。 RB:是一种重要的肿瘤抑制基因,在许多不同的癌肿里处于突变状态。这种基因的蛋白质产物是一种转录因子,其可控制驱使细胞进入分裂过程的重要基因表达(10)。 P21:是细胞周期蛋白依靠性激酶抑制剂家族中的重要成员。既与肿瘤抑制作用密切相关,又能通过抑制周期素依赖激酶CDKs复合物活性,协调细胞周期、DNA复制与修复之间的关系,从而将肿瘤抑制作用与细胞周期控制过程紧密相连(11~12)。 P53:是一个重要的抗癌基因,其野生型使癌细胞凋亡,从而防止癌变(13),还具有帮助细胞基因修复缺陷的功能。P53的突变型会提高癌变几率。 原癌基因与抑癌基因检测进行原癌基因与抑癌基因的检测,从经济型与便捷性方面考虑,使用qPCR方法较为合适。 常规qPCR方法检测,需要选取扩增/基因修饰前后的细胞,检测相应的原癌基因与抑癌基因的表达量变化。若扩增/基因修饰后细胞的基因表达量与先前细胞相差在2倍以内,则认为相关基因表达未有明显变化;若相关基因表达量相差2倍以上4倍以内,则认为相关基因表达量发生明显变化,细胞可能出现异常;若相关基因表达量相差4倍以上,则认为细胞发生致癌突变的可能性较大。 (以ACTB基因为内参,低代次细胞为对照细胞,采用2-△△Ct法计算数据) 在现有技术中,癌基因表达的检测往往是针对单一的基因进行的,对不同的癌基因的检测只能逐一进行,不仅检测时间长,检测耗材用量大,对于样本量少的珍贵样本更是难以进行高效的检测。为了解决上述技术问题,我方使用Taqman探针技术,进行单管多基因检测,在保证了检测结果的一致性同时,提高了检测通量,降低了检测成本,对标本量的要求也大大降低。目前我方已经将该方法申请专利,并已经进入实审阶段。 (单重PCR与多重PCR相比,Cq值差别不大) 该方法不仅可以比较细胞产品的癌基因表达量变化情况,亦可分析癌细胞与其他细胞的癌基因表达量差异 (不同细胞间癌基因表达量差异。可以看出,与MSC细胞相比,癌细胞的癌基因表达量有显著差异。) 细胞产品的原癌基因与抑癌基因检测已在我方检测目录中上线,可随时接受各方委托进行检测。 参考文献:【1】国家药品监督管理局药品审评中心. 人源性干细胞产品药学研究与评价技术指导原则(征求意见稿). 2021.【2】国家药品监督管理局. 细胞治疗产品研究与评价技术指导原则(试行). 2017.【3】王智超, 原涛. 癌基因、原癌基因与抑癌基因[J]. 中学生物学, 2004, 20(6):2-3.【4】Wu,S.,Turner,K.M.,Nguyen,N.et al. Circular ecDNA promotes accessible chromatin and high oncogene expression. Nature (2019) doi:10.1038/s41586-019-1763-5【5】Kelly K , Siebenlist U . The Regulation and Expression of c-myc in Normal and Malignant Cells[J]. Annual Review of Immunology, 1986, 4(1):317-338.【6】Lim K H . K-Ras[M]// Cancer Therapeutic Targets. 2013.【7】《实时荧光PCR技术》.第2版. 李金明. 科学出版社. 2016. pp.466.【8】Pai S R , Bird R C . c-fos expression is required during all phases of the cell cycle during exponential cell proliferation.[J]. Anticancer Research, 1994, 14(3A):985.【9】He, Yunlong. cFOS-SOX9 Axis Reprograms Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells into Chondroblastic Osteosarcoma[J]. Stem Cell Reports. 2017;8(6):1630‐1644.【10】Nevins, J. R . The Rb/E2F pathway and cancer[J]. Human Molecular Genetics, 2001, 10(7):699-703.【11】Brugarolas, J. p21 Is a Critical CDK2 Regulator Essential for Proliferation Control in Rb-deficient Cells[J]. The Journal of Cell Biology, 1998, 141(2):503-514.【12】Evodiamine selectively targets cancer stem-like cells through the p53-p21-Rb pathway[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2016, 469(4):1153-1158.【13】Greenblatt M S . Mutations in the p53 tumor suppressor gene : clues to cancer etiology and molecular pathogenesis[J]. Cancer Res. 1994, 54(18):4855-4878.