在细胞产品的生产过程中，往往需要进行体外培养，扩增至所需要数量用于后续使用。而细胞在体外经过多个代次的扩增，细胞内与细胞周期、分化相关的基因若发生突变，其表达水平会发生显著改变，影响细胞的各种生命活动；同时，又缺乏免疫系统的监控，无法及时清除异常细胞，一旦发生突变，很有可能改变细胞功能，甚至发展成癌细胞，反而造成新的危害。此种情况，在进行基因修饰/改造的细胞产品中发生几率更大。在国家药监局药品审评中心发布的《人源性干细胞产品药学研究与评价技术指导原则（征求意见稿）》第四章：风险评估与控制中提到：影响干细胞产品质量的风险因素具体包括但不限于：细胞的来源（自体、同种异体、iPSC 来源等）、生物学特性（增殖、分化、迁移能力、与目标治疗组织的谱系接近程度）以及基因突变等;
细胞的生产过程操作（体外培养/扩增/诱导/分化/遗传操作/冷冻保存/复苏等）及操作复杂程度对细胞特性的影响，如基因修饰对细胞基因组的影响(1)；
在国家药品监督管理局发布的《细胞治疗产品研究与评价技术指导原则. （试行）》第五章：非临床研究中提到：对于采用基因修饰/改造的细胞治疗产品，需关注有复制能力的病毒的产生和插入突变，特别是致癌基因的活化等特性带来的安全性风险(2)。为了检测细胞内相关致癌基因的变化，需要选定几种与癌症相关基因进行检测。通常细胞中存在原癌基因与抑癌基因两类。原癌基因是指存在于生物正常细胞基因组中的基因。正常情况下处于低表达或不表达状态，并发挥重要的生理功能。但在某些条件下，如病毒感染、化学致癌物或辐射作用等，原癌基因可被异常激活，转变为癌基因，能促进细胞增殖，阻止细胞凋亡使肿瘤逃逸周期抑制，从而使细胞失控生长诱导细胞发生癌变(3~4)。其中C‑MYC、 K‑RAS和C‑FOS这3种基因相对比较重要。C‑MYC：既是一种可易位基因，又是一种多种物质调节的可调节基因，也是一种可使细胞无限增殖，获永生化功能，促进细胞分裂的基因，与多种肿瘤发生发展有关(5)。K‑RAS：具有分子开关作用，在很多信号通路中具有重要作用(6)。研究表明约30％的人类恶性肿瘤与RAS基因突变有关，RAS突变后的产物可以一直处于活化状态。目前，K‑RAS基因突变状态检测在美国、欧洲及亚洲已经成为个体化靶向药物治疗的常规检测项目(7)。不合适的表达或突变，会直接干扰细胞周期的运行，或诱发细胞恶变、或在细胞周期的不同时期诱发细胞凋亡。C‑FOS：参与细胞的正常分化、生长以及学习、记忆等过程，在脑内与皮层、海马、边缘系统、背海马、纹状体内FOS蛋白的表达密切相关(8)。抑癌基因是一类可抑制细胞增殖从而潜在抑制癌变作用的基因。正常情况下，抑癌基因通过抑制细胞周期，促进细胞衰老，或促进细胞凋亡来监控细胞状态，防止细胞异常增殖(3~4)。其中RB、P21和P53这3种基因相对比较重要。RB：是一种重要的肿瘤抑制基因，在许多不同的癌肿里处于突变状态。这种基因的蛋白质产物是一种转录因子，其可控制驱使细胞进入分裂过程的重要基因表达(10)。P21：是细胞周期蛋白依靠性激酶抑制剂家族中的重要成员。既与肿瘤抑制作用密切相关，又能通过抑制周期素依赖激酶CDKs复合物活性，协调细胞周期、DNA复制与修复之间的关系，从而将肿瘤抑制作用与细胞周期控制过程紧密相连(11~12)。P53：是一个重要的抗癌基因，其野生型使癌细胞凋亡，从而防止癌变(13)，还具有帮助细胞基因修复缺陷的功能。P53的突变型会提高癌变几率。进行原癌基因与抑癌基因的检测，从经济型与便捷性方面考虑，使用qPCR方法较为合适。常规qPCR方法检测，需要选取扩增/基因修饰前后的细胞，检测相应的原癌基因与抑癌基因的表达量变化。若扩增/基因修饰后细胞的基因表达量与先前细胞相差在2倍以内，则认为相关基因表达未有明显变化；若相关基因表达量相差2倍以上4倍以内，则认为相关基因表达量发生明显变化，细胞可能出现异常；若相关基因表达量相差4倍以上，则认为细胞发生致癌突变的可能性较大。（以ACTB基因为内参，低代次细胞为对照细胞，采用2-△△Ct法计算数据）在现有技术中，癌基因表达的检测往往是针对单一的基因进行的，对不同的癌基因的检测只能逐一进行，不仅检测时间长，检测耗材用量大，对于样本量少的珍贵样本更是难以进行高效的检测。为了解决上述技术问题，我方使用Taqman探针技术，进行单管多基因检测，在保证了检测结果的一致性同时，提高了检测通量，降低了检测成本，对标本量的要求也大大降低。目前我方已经将该方法申请专利，并已经进入实审阶段。该方法不仅可以比较细胞产品的癌基因表达量变化情况，亦可分析癌细胞与其他细胞的癌基因表达量差异（不同细胞间癌基因表达量差异。可以看出，与MSC细胞相比，癌细胞的癌基因表达量有显著差异。）细胞产品的原癌基因与抑癌基因检测已在我方检测目录中上线，可随时接受各方委托进行检测。
【1】国家药品监督管理局药品审评中心. 人源性干细胞产品药学研究与评价技术指导原则（征求意见稿）. 2021.【2】国家药品监督管理局. 细胞治疗产品研究与评价技术指导原则（试行）. 2017.【3】王智超, 原涛. 癌基因、原癌基因与抑癌基因[J]. 中学生物学, 2004, 20(6):2-3.【4】Wu,S.,Turner,K.M.,Nguyen,N.et al. Circular ecDNA promotes accessible chromatin and high oncogene expression. Nature (2019) doi:10.1038/s41586-019-1763-5【5】Kelly K , Siebenlist U . The Regulation and Expression of c-myc in Normal and Malignant Cells[J]. Annual Review of Immunology, 1986, 4(1):317-338.【6】Lim K H . K-Ras[M]// Cancer Therapeutic Targets. 2013.【7】《实时荧光PCR技术》.第2版. 李金明. 科学出版社. 2016. pp.466.【8】Pai S R , Bird R C . c-fos expression is required during all phases of the cell cycle during exponential cell proliferation.[J]. Anticancer Research, 1994, 14(3A):985.【9】He, Yunlong. cFOS-SOX9 Axis Reprograms Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells into Chondroblastic Osteosarcoma[J]. Stem Cell Reports. 2017;8(6):1630‐1644.【10】Nevins, J. R . The Rb/E2F pathway and cancer[J]. Human Molecular Genetics, 2001, 10(7):699-703.【11】Brugarolas, J. p21 Is a Critical CDK2 Regulator Essential for Proliferation Control in Rb-deficient Cells[J]. The Journal of Cell Biology, 1998, 141(2):503-514.【12】Evodiamine selectively targets cancer stem-like cells through the p53-p21-Rb pathway[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2016, 469(4):1153-1158.【13】Greenblatt M S . Mutations in the p53 tumor suppressor gene : clues to cancer etiology and molecular pathogenesis[J]. Cancer Res. 1994, 54(18):4855-4878.
