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细胞产品致癌突变检测方法简介

作者:侯凯翔    来源:科诺
在细胞产品的生产过程中,往往需要进行体外培养,扩增至所需要数量用于后续使用。而细胞在体外经过多个代次的扩增,细胞内与细胞周期、分化相关的基因若发生突变,其表达水平会发生显著改变,影响细胞的各种生命活动;同时,又缺乏免疫系统的监控,无法及时清除异常细胞,一旦发生突变,很有可能改变细胞功能,甚至发展成癌细胞,反而造成新的危害。此种情况,在进行基因修饰/改造的细胞产品中发生几率更大。


现行法规要求

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在国家药监局药品审评中心发布的《人源性干细胞产品药学研究与评价技术指导原则(征求意见稿)》第四章:风险评估与控制中提到:影响干细胞产品质量的风险因素具体包括但不限于:

01


供体年龄、健康情况等;

02


细胞的来源(自体、同种异体、iPSC 来源等)、生物学特性(增殖、分化、迁移能力、与目标治疗组织的谱系接近程度)以及基因突变等;

03


细胞的生产过程操作(体外培养/扩增/诱导/分化/遗传操作/冷冻保存/复苏等)及操作复杂程度对细胞特性的影响,如基因修饰对细胞基因组的影响(1)





在国家药品监督管理局发布的《细胞治疗产品研究与评价技术指导原则. (试行)》第五章:非临床研究中提到:对于采用基因修饰/改造的细胞治疗产品,需关注有复制能力的病毒的产生和插入突变,特别是致癌基因的活化等特性带来的安全性风险(2)

为了检测细胞内相关致癌基因的变化,需要选定几种与癌症相关基因进行检测。通常细胞中存在原癌基因与抑癌基因两类。

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原癌基因与抑癌基因介绍

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原癌基因是指存在于生物正常细胞基因组中的基因。正常情况下处于低表达或不表达状态,并发挥重要的生理功能。但在某些条件下,如病毒感染、化学致癌物或辐射作用等,原癌基因可被异常激活,转变为癌基因,能促进细胞增殖,阻止细胞凋亡使肿瘤逃逸周期抑制,从而使细胞失控生长诱导细胞发生癌变(3~4)。其中C‑MYC、 K‑RAS和C‑FOS这3种基因相对比较重要。

C‑MYC:既是一种可易位基因,又是一种多种物质调节的可调节基因,也是一种可使细胞无限增殖,获永生化功能,促进细胞分裂的基因,与多种肿瘤发生发展有关(5)

K‑RAS:具有分子开关作用,在很多信号通路中具有重要作用(6)。研究表明约30%的人类恶性肿瘤与RAS基因突变有关,RAS突变后的产物可以一直处于活化状态。目前,K‑RAS基因突变状态检测在美国、欧洲及亚洲已经成为个体化靶向药物治疗的常规检测项目(7)。不合适的表达或突变,会直接干扰细胞周期的运行,或诱发细胞恶变、或在细胞周期的不同时期诱发细胞凋亡。

C‑FOS:参与细胞的正常分化、生长以及学习、记忆等过程,在脑内与皮层、海马、边缘系统、背海马、纹状体内FOS蛋白的表达密切相关(8)

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(原癌基因参与干细胞分化(9)

抑癌基因是一类可抑制细胞增殖从而潜在抑制癌变作用的基因。正常情况下,抑癌基因通过抑制细胞周期,促进细胞衰老,或促进细胞凋亡来监控细胞状态,防止细胞异常增殖(3~4)。其中RB、P21和P53这3种基因相对比较重要。

RB:是一种重要的肿瘤抑制基因,在许多不同的癌肿里处于突变状态。这种基因的蛋白质产物是一种转录因子,其可控制驱使细胞进入分裂过程的重要基因表达(10)

P21:是细胞周期蛋白依靠性激酶抑制剂家族中的重要成员。既与肿瘤抑制作用密切相关,又能通过抑制周期素依赖激酶CDKs复合物活性,协调细胞周期、DNA复制与修复之间的关系,从而将肿瘤抑制作用与细胞周期控制过程紧密相连(11~12)

P53:是一个重要的抗癌基因,其野生型使癌细胞凋亡,从而防止癌变(13),还具有帮助细胞基因修复缺陷的功能。P53的突变型会提高癌变几率。

原癌基因与抑癌基因检测

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进行原癌基因与抑癌基因的检测,从经济型与便捷性方面考虑,使用qPCR方法较为合适。

常规qPCR方法检测,需要选取扩增/基因修饰前后的细胞,检测相应的原癌基因与抑癌基因的表达量变化。若扩增/基因修饰后细胞的基因表达量与先前细胞相差在2倍以内,则认为相关基因表达未有明显变化;若相关基因表达量相差2倍以上4倍以内,则认为相关基因表达量发生明显变化,细胞可能出现异常;若相关基因表达量相差4倍以上,则认为细胞发生致癌突变的可能性较大。

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(以ACTB基因为内参,低代次细胞为对照细胞,采用2-△△Ct法计算数据)

在现有技术中,癌基因表达的检测往往是针对单一的基因进行的,对不同的癌基因的检测只能逐一进行,不仅检测时间长,检测耗材用量大,对于样本量少的珍贵样本更是难以进行高效的检测。为了解决上述技术问题,我方使用Taqman探针技术,进行单管多基因检测,在保证了检测结果的一致性同时,提高了检测通量,降低了检测成本,对标本量的要求也大大降低。目前我方已经将该方法申请专利,并已经进入实审阶段。

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(单重PCR与多重PCR相比,Cq值差别不大) 

该方法不仅可以比较细胞产品的癌基因表达量变化情况,亦可分析癌细胞与其他细胞的癌基因表达量差异

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(不同细胞间癌基因表达量差异。可以看出,与MSC细胞相比,癌细胞的癌基因表达量有显著差异。)

细胞产品的原癌基因与抑癌基因检测已在我方检测目录中上线,可随时接受各方委托进行检测。

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参考文献:
【1】国家药品监督管理局药品审评中心. 人源性干细胞产品药学研究与评价技术指导原则(征求意见稿). 2021.
【2】国家药品监督管理局. 细胞治疗产品研究与评价技术指导原则(试行). 2017.
【3】王智超, 原涛. 癌基因、原癌基因与抑癌基因[J]. 中学生物学, 2004, 20(6):2-3.
【4】Wu,S.,Turner,K.M.,Nguyen,N.et al. Circular ecDNA promotes accessible chromatin and high oncogene expression. Nature (2019) doi:10.1038/s41586-019-1763-5
【5】Kelly K , Siebenlist U . The Regulation and Expression of c-myc in Normal and Malignant Cells[J]. Annual Review of Immunology, 1986, 4(1):317-338.
【6】Lim K H . K-Ras[M]// Cancer Therapeutic Targets. 2013.
【7】《实时荧光PCR技术》.第2版. 李金明. 科学出版社. 2016. pp.466.
【8】Pai S R , Bird R C . c-fos expression is required during all phases of the cell cycle during exponential cell proliferation.[J]. Anticancer Research, 1994, 14(3A):985.
【9】He, Yunlong. cFOS-SOX9 Axis Reprograms Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells into Chondroblastic Osteosarcoma[J]. Stem Cell Reports. 2017;8(6):1630‐1644.
【10】Nevins, J. R . The Rb/E2F pathway and cancer[J]. Human Molecular Genetics, 2001, 10(7):699-703.
【11】Brugarolas, J. p21 Is a Critical CDK2 Regulator Essential for Proliferation Control in Rb-deficient Cells[J]. The Journal of Cell Biology, 1998, 141(2):503-514.
【12】Evodiamine selectively targets cancer stem-like cells through the p53-p21-Rb pathway[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2016, 469(4):1153-1158.
【13】Greenblatt M S . Mutations in the p53 tumor suppressor gene : clues to cancer etiology and molecular pathogenesis[J]. Cancer Res. 1994, 54(18):4855-4878.


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